Utrata komórek B u pacjentów z mutacjami heterozygotycznymi w IKAROS czesc 4

Wcześniej opublikowane badania strukturalne wskazują, że mutacje missensowe R162L, R162Q i R184Q występują w kontakcie z DNA reszty, podczas gdy mutacja H167R obejmuje jeden z kanonicznych histydyn C2H2 z cynkiem palcem (patrz fig. S2 w dodatkowym dodatku do struktury IKAROS). 15 Ponadto przewiduje się, że te cztery mutacje będą wysoce szkodliwe dla funkcji białka (fig. Mutacje punktowe nie były obserwowane w ponad 64 000 genomów zawartych w projekcie 1000 Genomes i bazie danych Exome Aggregation Consortium (ExAC). W tych bazach danych nie znaleziono przedwczesnych kodonów stop w IKZF1, a kilka zgłoszonych mutacji missense było albo bardzo rzadkich, albo przewidzianych jako łagodne. Ponadto IKZF1 znajduje się pod silną selekcją oczyszczającą (ryc. S4 w dodatku uzupełniającym), co oznacza, że osoby z dysfunkcjonalnymi wariantami nie przeżywają do wieku rozrodczego. Na koniec, DNA od 132 dodatkowych pacjentów z CVID, w tym 21 pacjentów z niską liczbą komórek B, analizowano pod względem mutacji w IKZF1 za pomocą sekwencjonowania całego egzonu lub sekwencjonowania Sanger eksonów, ale nie zidentyfikowano żadnych dodatkowych mutacji. Analiza funkcjonalna mutacji IKZF1
Cytometria przepływowa wykazała, że ilość IKAROS w komórkach T i komórkach B od uczestników badania z substytucjami aminokwasowymi była równa wartości w komórkach T i komórkach B od kontroli, podczas gdy komórki T i komórki B od uczestników z dużą delecją miały około połowa normalnej ilości IKAROS (ryc. S5 w dodatku uzupełniającym). Aby zbadać stabilność białek wynikających z czterech mutacji missense w IKZF1 (R162L, R162Q, H167R i R184Q) oraz zdolność tych białek do dimeryzacji dzikiego typu IKAROS i dostania się do jądra, transfekowaliśmy komórki HEK293T typy i zmutowane wektory ekspresyjne. Analiza Western ekstraktów z cytoplazmy i jądra transfekowanych komórek wykazała, że te zmutowane białka były stabilne, dimeryzowane za pomocą dzikiego typu IKAROS i były zdolne do migracji do jądra (ryc. S6 w dodatku uzupełniającym). Ekstrakty jądrowe z transfekowanych komórek zastosowano w teście zmiany ruchów elektroforetycznych (EMSA) w celu oceny zdolności zmutowanych białek do wiązania sekwencji wiążącej consensus IKAROS (IK-bs4) 15 i sondy z regionu pericentromerowego ludzkiego chromosomu 8 (.Sat8) .19 Czterech białek powstających w wyniku mutacji missense nie udało się związać tych sond (ryc. S7A i S7B w dodatku uzupełniającym). W celu określenia, czy podstawienia aminokwasów skutkowały dominującym negatywnym efektem i naśladowaniem stanu heterozygotycznego, przeprowadziliśmy EMSA z ekstraktami jądrowymi z ludzkich embrionalnych komórek nerki 293T (HEK293T) transfekowanych wektorem wyrażającym w 100% IKAROS typu dzikiego lub wektory wyrażające 50% mutacja typu dzikiego i 50% IKAROS. Wiązanie DNA zostało zredukowane o 38 do 74% w komórkach transfekowanych 50% wektorami typu dzikiego i zmutowanych 50%, w porównaniu z komórkami transfekowanymi w 100% wektorem typu dzikiego. To odkrycie było zgodne ze zmniejszeniem ilości wektora dzikiego stosowanego w transfekcji (Fig
[podobne: badania okresowe jak wyglądają, klinika ortodontyczna warszawa, eskulap żary rejestracja ]

Powiązane tematy z artykułem: badania okresowe jak wyglądają eskulap żary rejestracja klinika ortodontyczna warszawa